Primer3 là chương trình được sử dụng phổ biến để thiết kế mồi (primer) cho phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction). Đây là chương trình mã nguồn mở, do Steve Rozen and Helen Skaletsky phát triển tại Whitehead Institute và Howard Hughes Medical Institute, USA. (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) Primer3 cũng có thể dùng để thiết kế các mẫu dò (probe) và các primer cho giải trình tự.
Vì PCR được sử dụng cho nhiều mục đích khác nhau nên Primer3 có nhiều các thông số mà bạn có thể điều chỉnh để tạo ra những primer tốt nhất cho mục đích của bạn.
Đây là giao diện của chương trình Primer3:
Ở đây tôi chỉ hướng dẫn các bạn sử dụng chương trình này một cách đơn giản nhất thông qua ví dụ sau:
VD: Một loài thực vật hoặc vi sinh vật nào đó đã được chuyển gene biểu hiện protein huỳnh quang eGFP (enhanced green fluorescent protein). Bây giờ sinh vật này đã có thể phát sáng, nhiệm vụ của bạn là thiết kế primer đặc hiệu cho gene eGFP để kiểm tra xem gene này đã được gắn vào genome của sinh vật hay chưa.
Để thiết kế mồi, bạn cho trình tự của gene eGFP (720 bp) vào khung chính của Primer3:
ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAA
ACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTT
CATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAG
TGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACG
TCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGG
CGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCAC
AAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGG
TGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACAC
CCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAA
GACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCA
TGGACGAGCTGTACAAGTAA
Bạn hãy nhấp chuột vào Pick Primers để tìm ra cặp primer tốt nhất (mồi bên trái và mồi bên phải) mà chương trình đề nghị.
Kết quả là bạn sẽ nhận được 1 cặp mồi chính (ở đầu cửa sổ)
và 4 cặp mồi bổ sung (ở cuối cửa sổ)
Tuy nhiên các cặp mồi chính và phụ chỉ cho sản phẩm PCR với kích thước <220 bp và chỉ phù hợp cho Real-Time PCR. Đối với PCR thông thường, sản phẩm nên >250 bp để dễ dàng quan sát được trên bản Gel sau khi điện di.
Để nhận được cặp mồi hoàn hảo cho sản phẩm > 250 bp (thường là 500-1000 bp), bạn có thể sử dụng mẹo như sau:
Bạn kết hợp mồi trái của cặp mồi chính với mồi phải của một trong các cặp mồi phụ (2 hoặc 3 hoặc 4): copy mồi trái của cặp chính và mồi phải của cặp phụ, dán vào khung dành cho mồi trái và mồi phải, kiểm tra với Pick Primers.
Mồi trái (chính) + Mồi phải (phụ 2)
Kết quả: 2 mồi này không thể kết hợp với nhau (No Acceptable Primers Were Found)
Mồi trái (chính) + Mồi phải (phụ 3)
Kết quả: 2 mồi này kết hợp tốt với nhau (sản phẩm PCR là 552 bp)
Mồi trái (chính) + Mồi phải (phụ 4)
Kết quả: 2 mồi này cũng kết hợp tốt với nhau (sản phẩm PCR là 551 bp)
Như vậy bạn có thể sử dụng 1 trong 2 cặp mồi sau để thực hiện phản ứng PCR đặc hiệu cho gene eGFP:
Cặp 1:
Mồi xuôi (Forward primer):
eGFP-FW: ACGTAAACGGCCACAAGTTC
Mồi ngược (Reverse primer):
eGFP-RV: ACTGGGTGCTCAGGTAGTGG
Cặp 2:
Mồi xuôi (Forward primer):
eGFP-FW: ACGTAAACGGCCACAAGTTC
Mồi ngược (Reverse primer):
eGFP-RV: CTGGGTGCTCAGGTAGTGGT
